Грибные заболевания. В большинстве случаев диагностика грибных заболеваний растений не затруднительна, особенно, если возбудитель болезни на растении находится в зрелом состоянии, т.е. вызывает характерные симптомы, хорошо спороносит и легко может быть определен до вида методом обычного микроскопироваяия. Иногда при наличии явных признаков болезни (увядание, гниль, пятнистость и т.д.) спороношение гриба по каким-либо причинам отсутствует. Чаще всего это обусловлено недозрелостью гриба,способностью его обитать внутри тканей пораженных органов растений в вегетативном состоянии, устойчивостью растений, сухостью окружающего воздуха. В таких случаях определение возбудителя болезни возможно лишь в результате применения дополнительных приемов диагностики (влажные камеры, выделение возбудителя в чистую культуру и др.)

Влажные камеры. Наиболее простой способ вызвать спороношение гриба - помещение исследуемого объекта во влажную камеру. Для ее изготовления используют чашки Петри или. Коха, дно и внутреннюю поверхность крышки которых выстилав; стерильной фильтровальной бумагой, увлажняют по возможности стерильной водой. Небольшие кусочки изучаемого объекта после поверхностной стерилизации или тщательного обмывания водой закладывают на фильтровальную бумагу, выстилающую дно чашки, в количестве от 3 до 10 (в зависимости от объекта), но с таким расчетом, чтобы кусочки не соприкасались и бы­ли не ближе 1 см от боковых стенок. Стерилизация необходима для уничтожения посторонней микрофлоры, находящейся на поверхности кусочков ткани. Перед стерилизаци­ей исследуемый орган тщательно отмывают в нескольких водах.

Стерилизация кусочков ткани или семян, а также склероциев может быть осуществлена в 96 или 50% спирте (2-3 минуты); в 0,1% (1:1000) растворе сулемы (до 3 минут); в 0,1-1,0% растворе бромной вода (несколько секунд); во всех случаях с последующей многократной промывкой в стерильной воде. С этой же целью используют простое фламбирование объектов в пламени спиртовки (иногда с предварительным смачиванием объекта в спирте). В результате таких приемов спороносщий гриб в виде почти чистой культуры можно получить через 15-20 часов. Грибы, развившиеся во влажных камерах, лучше исследовать непосредственно в чашках под слабым увеличением микроскопа.

Чистые культуры гриба. К выделению возбудителей болезней в чистую культуру на искусственные питательные среды прибегают, когда исследование их во влажной камере не обеспечивает развития паразитного гриба и его спороношения, по которому можно было бы определить возбудителя болезни. Перечень искусственных и естественных питательных сред довольно разнообразен . Способы стерилизации кусочков ткани пораженных растений перед закладкой на среды те же, что и при помещении их во влажные камеры.

Для приготовления элективных питательных сред используют, например, агаровые среды с отваром или настоями (вытяжками) из растенияхозяина. Агар с отваром растений хозяев готовится из расчета 100 г свежих или 50 г высушенных растений или их частей на 1 л воды. Растения измельчают, кипятят I час, восстанавливают первоначальный объем жидкости, фильтруют, после чего применяют вместо воды, как при изготовлении обычного агара. Настои из тех же веществ готовятся без кипячения, путем выдерживания объектов в воде несколько часов или даже суток, после чего настой сливается, фильтруется и стерилизуется.

Методика микроскопических исследований (определение вида). Для приготовления препаратов используют слабый водный раствор краски. Микроскопировшше следует производить тотчас после приготовления препарата. Удобный фиксатор: вода дистиллированная Т/3 объема, спирт-ректификат 1/3 объема, глицерин 1/3 объема,несколько капель 0,01% спиртового раствора метиленового синего.Полученные препараты сохраняются в течение длительного времени, жидкость не высыхает, клетки гифмицелия и конидий не проростают.

Для улучшения видимости контуров конидий, перегородок макроконидий и мицелия, а также для наблюдения за структурой клеточного содержимого необходимо добавление к данному фиксатору красок. Наиболее пригодны метиленовнй синий и нейтральный красный (несколько капель на 100 мл фиксатора). Метиленовнй синий (0,01% водный или спиртовой растворы) добавляют в количестве 0,5-1,0 мл на 100 мл фиксатора.
При специальных исследованиях по изучению характера прорастания спор, роста мицелия и строения конидиеносцев применяются различные методы “живых препаратов”, “висячие капли”, микрокуль туры и др. При микроскопировании препаратов отмечаются наличие макро и микроконидий, хламидоспор, эцйдий, сумок, базидий и их зарисовка.

Определение размеров спор производится путем измерения длинн и ширины окуляр-микрометром при значительном увеличении микроскопа (1000 раз). Опоры измеряют в нескольких полях зрения микроскопа (50-100 раз). Затем определяют наиболее часто встречаемые размеры, средние размеры. Вид гриба устанавливают по различным определителям. После оценки состояния обследуемых растении, тщательного осмотра проб, выявления болезни отбираем образцы растений с хорошо выраженными признаками болезней с целью гербаризации.

Методика гербаризации. Травянистые растения собирают целиком, включая плоды, цветы и корни; у деревьев и кустарников преимущественно ветки с листьями. Обычно собирают части растении с признаками поражения в виде налетов, пятнистоетей, подушечек, вздутий, деформаций, язв и т.д., а также без видимых признаков, но засыхающие или с внезапно осыпающимися листьями.
Для получения спороношения от склеропиев, недоразвитых перитециев, различных строи и других неспороносящих форм туябоъ их вместе с частицами пораженных растений рекомендуют помещать с осени на зимовку в кассеты Кяебана. Образцы пораженных растений сразу же после сбора закладывают в ботаническую папку или сетку и отделяют друг от друга фильтровальной бумагой.

Если образцы завяли, то их тщательно расправляют; те из них, которые не могут быть заложены в ботаническую сетку (ветви, клубни и плоды), заворачивают в бумагу. У каждого образца должна быть этикетка (место и дата сбора, вид и сорт растения). Сочные плоды, корнеплоды фиксируют в консервирующих жидкостях (спирт 70%, формалин 5%, смесь спирта с формалином, растворы поваренной соли 8-9%, медный купорос 1%).
Для более длительного хранения применяют - 180 г с негашеной известью (СаО) - 180 г и водой - 22,7 л. Сульфат меди растворяют в течение ночи в 2 л воды, известь гасят в 20,7 л вода и пропускают через тонкое сито. Раствор используют сразу после приготовления.
В музее основной консервант формальдегид (40%) 25 мл,спирт 95% - 150 мл и вода - Гл. Для сохранения зеленой окраски образцы помещают в кипящую смесь, состоящую из одной части ледяной уксусной кислоты, насыщенной кристаллическим ацетатом меди и 4 г вода; кипятят 1-2 мин и хранят в 5% растворе формалина. Диагностика и идентификация бактериальных и вирусных болезней имеет свою специфику.

Бактериальные заболевания. При некоторых бактериозах внешние симптомы бывают настолько характерны, что на основании их можно определить заболевание и его возбудителя. Однако такие случаи немногочисленны. Обычно внешнего осмотра растения бывает недостаточно, поэтому для установления причины заболевания выделяют возбудителей из пораженных частей и определяют их видовую принадлежность. Для этого надо отобрать пораженные растения и провести бактериологические анализы . Берут обычно свежие растения с наиболее типичными признаками поражения, потому что некоторые фитопатогенные бактерии быстро погибают в отобранных частях, а другие выделяются из сухого материала с большим трудом.

Выделение возбудителя в чистую культуру проводят из образцов с начальной стадией заболевания, так как в отмершей ткани развивается обильная не специфическая микрофлора. Материал для анализа собирают по возможности в стерильную бумагу или посуду и быстро доставляют в лабораторию. Если собранный материал не может быть проанализирован немедленно, то его консервируют. С этой целью из образцов листьев готовят гербарий. Стебли с признаками гнили подсушивают. Клубни, корнеплоды, луковицы и другие загрязненные почвой органы растений очищают от земли и обсушивают в тени на воздухе. В случае транспортировки пораженного материала используют фильтровальную или газетную бумагу, избегая применения целлофана и полиэтиленовой пленки.

К каждому образцу прилагают описание внешних признаков заболевания. Для выявления бактериальной природы болезни из пораженных тканей растения предварительно готовят препараты различными способами, что зависит от состояния растительной ткани. Скальпелем вы­резают небольшие пораженные кусочки ткани (5-7 см), из которых бритвой готовят тонкие срезы (кусочки можно закладывать в бузину). Срезы помещают в кашпо воды на чистое обеззараженное предметное стекло и окрашивают прижизненно или готовят фиксированные препараты. Из сухих пораженных тканей можно готовить препараты соскобы. Соскобленную скальпелем ткань переносят в каплю вода на обезжиренное предметное стекло и репномерно распределяют тонким слоем по его поверхности. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют 2-3 раза над пламенем горелки, окрашивают.

Из свежеприготовленных тканей сочных стеблей, плодов, клубней, корнеплодов готовят препараты отпечатки. Скальпелем срезают наружную ткань и к поверхности среза прикладывают чистое обезжиренное предметное стекло. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают. Обнаружив на одном из указанных препаратов присутствие большого количества однородных, очень мелких коротких палочек (бактерий), делают заключение о бактериальной природе заболевания.

Бактериологический анализ растенпя проводят различными методами в зависимости от пораженного органа, типа болезни, состояния анализируемого образца (свежий или гербарный материал) и др. Приступая к выделению бактерий из растений, в зоне пламени горелки разливают расплавленные и охлажденные до 50-60 С питательные среды (картофельный, мясопептонный агар и др.) в заранее приготовленные стерильные чашки Петри. Это лучше всего делать в специальном лабораторном боксе на столе, покрытом пластиком или стеклом, который перед работой протирают спиртом.

Для анализа из исследуемого образца на границе больной и здоровой ткани предварительно флашрованным (проведенным через пламя горелки) и остуженным скальпелем вырезают небольшие кусочки, которые промывают в течение 20-30 мин проточной водопроводной водой в специальных ситечках или марлевых мешочках, подвешенных к водопроводному крану. Если анализируют кусочки корней иди гербарный материал, то срок промывки в водопроводной воде удлиняют. После этого образцы переносят в пробирки со стерильной водой. Отвивочной петлей, предварительно фламированной, кусочки ткани погружают в воду первой пробирки и слегка встряхивают в течение 3-5 мин, не смачивая ватной пробки. Подвинув образцы прокаленной и остывшей петлей к краю пробирки, фламированным пинцетом переносят во вторую пробирку со стерильной водой, где вторично встряхивают в течение 3-5 мин.

Аналогично образец промывают и в последующих пробирках со стерильной водой, расходуя не менее 5 пробирок. Такое тщательное отмывание освобождает от применения антисептиков для поверхностной дезинфекции материала, которую в большинстве случаев не проводят во избежание уничтожения бактерий возбудителей. К дезинфекции прибегают лишь при исследовании деревянистых частей растений (покрытых пробковой тканью ветвей, опухолей растений и др.), а также семян при анализах на внутреннюю (глубинную) инфекцию. В указанных случаях дезинфекцию производят погружением материала в 96° спирт на 1-2 мин, в раствор сулемы (0,1%) в течение 1-2 глин или в 0,5% раствор марганцовокислого калия с экспозицией 5-20 мин с последующей промывкой в стерильной воде.
Можно использовать раствор формалина 1:100 в течение 5 мин с последующим трехчасовым томлением. Тщательно промытый кусочек пораженной ткани подвергают бактериологическому анализу. Существует несколько методов выделения возбудителей.

Посев из растертого материала. Хорошо промытый кусочек растительной ткани переносят в стерильную ступку, помещенную в непосредственной близости к пламени горелки, и растирают пестиком с добавлением нескольких капель стерильной вода до получения однородной массы. Предварительно прокаленной на пламени горелки и охлажденной Петлей берут одну кашпо образовавшейся суспензии, переносят в чашку Петри на поверхность плотной питательной среды и равномерно растирают шпателем. Этим же шпателем проводят посев во второй и третьей чашках Петри для получения большого количества изолированных колоний.

Метод накопления. Тщательно промытый материал стерильно переносят в пробирку с жидкой питательной средой (мясопептонный бульон, среда Омеланского и др.) и выдерживают в термостате до появления признаков роста (чаще 1-3 суток). Затем предварительно прокаленной на пламени горелки петлей берут одну каплю помутневшей питательной среды и переносят на поверхность плотной питательной среды в чашку Петри, где растирают шпателем.
Этим же шпателем осуществляют посев еще в двух чашках Петри. Если имеются сочные органы растений (плоды, корнеплоды, луковицы, сочные стебли и т.д.) с признаками размягчения ткани, то фламированным и охлажденным Скальпелем стерильно срезают наружную ткань.

На границе больной и здоровой тканей предварительно прокаленной петлей берут одну каплю слизи, выступающей при продавливании, и переносят в чашку Петри на поверхность плотной питательной среды, где ее распределяют шпателем. Им же инфекционный материал раотирают еще в двух чашках Петри. После посева чашку Петри в перевернутом (дном вверх) виде помещают в термостат с температурой 26-28°С.
При появлении бактериальных колоний (в большинстве случаев через 1-3 дня после посева) чашки вынимают из термостата выросшие колонии исследуют,изолируют в пробирки, и приступают к проверке патогенности бактерий. Выделение фитопатогенннх бактерий из пораженных растений осложняется тем, что в них наряду с возбудителями бактериозов находится много посторонних микробов. Особенно много споровых и других грамположительннх бактерий встречается при аиализах загрязненных почвой органов растений.

Для подавления роста этих микроорганизмов в плотные питательные среды добавляют различные анилиновые краски (малахитовая зелень, генцианвиолет или кристаллвиолет), которые задерживают рост споровых и грамположктельных микроорганизмов, почти не влияя на грамотрицателънне бактерии. Указанные краски добавляют в среды в концентрации 1:100 000.
Лучшие результаты дает малахитовая зелень. Растворяют 1 г ыалахлтгрюна в 100мл спирта и оставляют на сутки. Затем раствор фильтруют и к одному литру мясопентонного агара добавляют 1 мл малахитовой эелени (1 :100000). Стерилизация обычная.

Поскольку в пораженных органах растений развивается много споровых и грамположительных форм микроорганизмов, после посева на мясопептонный агар рекомендуется одновременно сеять на мясопептонный агар с малахитгрюном. Чашки с добавлением зеленой краски необходимо помечать, так как при развитии микроорганизмов краска может восстанавливаться. Следует помнить, что агар с малахитгрвном нельзя применять при выделении грамположительных бактерий. Для их выделения к питательным средам добавляют двухромовокислнй калий, который, задерживает рост грамотрицательных бактерий.

При анализе семян на зараженность бактериозами используют влажные камеры, для создания которых, берут чашки Петри, Коха или фаянсовые растильни. На дно кладут слой гигроскопической ваты, покрытой двумя слоями фильтровальной бумаги. Подготовленные чашки стерилизуют в сушильном шкафу при 130°С в течение 3 часов или в автоклаве при 2 атм. 30-40 мин. Растильни дезинфицируют спиртом.Перед раскладкой семян подстилки из ваты и фильтровальной бумаги увлажняют стерильной водой. Раскладку семян проводят с соблюдением стерильности. Использованные металлические инструменты (ланцеты, пинцеты, иглы) фламбируют. Чашки Петри, Коха или растильни с разложенными на них семенами в количестве не менее 1ОО шт.. помещают в термостат с температурой, оптимальной для прорастания семян исследуемой культуры (от 20 до 30 С).

Начиная со второго третьего дня, систематически ведут наблюдения за проявлением признаков бактериального поражения семян и проростков. При этом обращают внимание на появление капелек мутной жидкости (экссудата) разной окраски, а также на загнивание, ослизненные и непроросшйе семена, что может быть следствием сильного поражения бактериями. Пораженность таких семян бактериями можно обнаружить при раздавливании. Иногда у семян отсутствуют внешние признаки бактериоза, но вследствие наличия внутренней инфекции из них вырастают проростки, имеющие пятна или язвочки на семядолях, признаки мокрой гнили на стебельке, корешках и т.д.
Все это учитывают при фитолатологической экспертизе семян. При определении зараженности семян наиболее радикальным является бактериологический анализ с использованием метода посева из растертого материала. После тщательного промывания стерильной водой семена растирают в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды и полученную суспензию высевают на плотную питательную среду.

Питательные среды и методы стерилизации. Питательные среды необходимы для выделения фитопатогенных бактерий из пораженных частей растений, их культивирования, изучения кулылаяьнобиохимических свойств и сохранения. Многие составные компоненты (агарагар, желатин и др.), из которых готовят питательные среды для грибов, используют и для выращивания бактерий. Однако состав питательных сред для возбудителей бактериозов и способы их приготовления тлеют свою специфику. Основной отличительной особенностью является их реакция среды для бактерий должны иметь нейтральную или слабощелочную реакцию (рН 7,0-7,5). Кроме того, режим стерилизации таких сред должен быть более строгим, чем для микологических, исследований.

По составу питательные среды делятся на белковые (растительного и животного происхождения) и безбелковые (синтетические).Состав белковых сред не постоянен, что затрудняет их использование для изучения некоторых физиологических особенностей микроорганизмов (потребность в элементах питания и т.д.). Синтетические среды обычно стандартные, с постоянным химическим составом, который можно контролировать в процессе культивирования микроорганизмов. Их используют для изучения физиологии возбудителей бактериозов, выделения из растения, диагностики патогенов и т.д. Элективные среды применяют для выделения специфических групп фитопатогенных бактерий.

Стерилизация. Воду, большинство питательных сред и посуду стерилизуют паром под давлением в автоклаве. Полная стерилизация достигается при давлении в 1-1,5 атм. в течение 20-30 мин. Некоторые питательные среды (молоко, желатин, среды с углеводами и др.) нз выдерживают такого режима стерилизации, так как происходит частичная карамелизация Сахаров и т.д. Поэтому указанные среды стерилизуют при давлении 0,5 атм. в течение 10 мин или дробно в кипятильнике Коха. В связи с тем, что время стерилизации непродолжительно, эти среды разливают в заранее заготовленные стерильные пробирки.

Стерилизацию текучим паром (дробную стерилизацию) осуществляют в кипятильнике Коха при 100 с в течение трех дней но 30 мин ежедневно. Предполагается, что при нагревании в первый день гибнут вегетативные клетки микроорганизмов. Оставшиеся жизнеспособные опоры успевают прорасти в новые вегетативные клетки до следующего дня и гибнут при повторном нагревании. Дробно стерилизуют молоко (простое и с лакмусом), желатин, среды с углеводами и др.

Проверка патогенности бактерий. Через несколько дней после посева растертой кашицы растений на плотине питательные среды в чашки Петри образуются видимые невооруженным глазом колонии бактерии, внешний вид которых имеет значение для определения вида фитопатогенннх бактерий. Колонии просматривают сначала невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете, а затем при малом увеличений микроскопа. Для этого чашку Петри, не открывая, помещают на столик микроскопа в перевернутом виде (дном вверх). Обращают внимание на размер колоний, форму, структуру и консистенцию, поверхность, профиль, края, цвет и .др. При развитии на искусственных пйтательних средах колоши сапрофитных бактерия обычно имеют более крупные размеры.

У большинства возбудитителей бактериозов они, напротив, более мелкие, блестящие, слизистые, прозрачные, белого, белосерого или различных оттенков желтого цвета. Форма колонии круглая, края чаще ровные, реже слегка волнистые или изрезанные, поверхность в основном гладкая или мелкозернистая. Колонии, сходные с таковыми определяемого фитопатогена по внешним признакам, Отмечают кружком воскового карандаша или туши (по дну чашки); ставят номера около обведенного кружка, соответствующие цифры на пробирках и приступают к выделению культуры. Для посева в пробирку выбирают однородную по внешнему виду колонию,расположенную изолированно от других.Изоляцию делают с соблюдением правел стерильности.

Пробирку с косым агаром зажимают средним пальцем левой руки (скошенная сторона агара должна быть обращена вверх), обжигают Отвивачнув петлю на пламени, приоткрывают чашку Петри, берут петлей материал из колонии и закрывают крышку. Затем открывают пробирку со средой, зажимая ватную пробку ладонью и мизинцем правой руки; обжигают край пробирки, вводят петлю и делают пооев штрихом, проводя петлей прямую тля зигзагообразную линию да поверхности косого агара. После этого обжигают край пробирки и закрывают ее, не вынимая из пламени, пробкой. Закончив изоляцию, прокаливают отвивочную петлю. Пробирки помещают в термостат. При проведении бактериологических работ (посев, выделение, пересев) следят за тем, чтобы не было движения воздуха в помещении; окна и двери должны быть закрыты, хождение прекращено.

Более удобны в этом отношении специальные лабораторные боксы. Когда изолированные культуры вырастут на плотной питательной среде в пробирках, приступают к проверке их патогенности в отношении растений хозяев, что очень важно, так как морфологокультуральные свойства многих фитопатогениых бактерий иногда полностью совпадают со свойствами салрофитов и различить их только по этим признакам невозможно.

Вначале латогенность изолированных штаммов проверяют путем искусственного заражения определенного вида растения, из которого данный микроорганизм был выделен. Для инокуляции по возможности отбирают молодые растения, к которым привязывают этикетки с указанием номера штамма бактерии и даты инокуляции. Для искусственного заражения используют свежие (одно, двуоуточные) культуры бактерий, выращенные на плотной питательной среде, иа которых готовят суспензии. Маленькие капли суспензии наносят на нижнюю поверхность листовой пластинки или другие части растений стерильной пастеровской пипеткой, после чего сквозь капли делают мелкие уколы тонкой стерильной иглой, поскольку большинство фитопатогенннх бактерий проникают в растения через ранения.

При инокуляции растений с тонкими листьями во избежание сквозных проколов используют тонкие энтомологические булавки, предварительно простершшзованные. Для выяснения способности возбудителя поражать сосудистую систему и вызывать увядание растений каплю бактериальной взвески наносят на центральную жилку листовой пластинки, черешок листа или стебель, а затем делают укол через нанесенную каплю. На толстых стеблях лучше делать надрезы бритвой. Возбудителями увядания, изолированными из растений с пораженной сосудистой системой (потемнение сосудов, выделение иэ них слизистого экссудата и т.п.), обычно инокулйруют жилки и черешки листьев уколом, а на стеблях при этом делают надрезы бритвой.

Места заражения обвязывают влажной стерильной ватой во избежание подсыхания культуры. Заражать сочные стебли, плоды, луковицы, клубни, корнеплода и т.д. можно с помощью шприца, вводя в места заражения одинаковое количество суспензии бактерий. Перед заражением плода тщательно промывают стерильной водой; загрязненные почвой клубни, луковицы, корнеплоды и другие органы растений предварительно освобождают от почвенных частиц и промывают водопроводной стерильной водой.
Перед проверкой патогенности штаммов делают уколы в стебли и листья контрольных растений, заменяя чистую культуру возбудителя стерильной водой. Механические повреждения наносят таким же образом, как и при инокуляций. Контрольные растения располагают на некоторое расстояние от опытных во избежание передачи инфекции при соприкосновении с зараженными растениями, с брызгами вода при поливе или переносе бактерий Насекомыми.

При первичной проверке патогенноети.выделенной культуры проводят заражение листьев различных ярусов на 5-10 растениях. Для ера? мольной оценки патогенных свойств бактерий большое значение имеет подбор объектов . Они должны быть здоровыми и находиться в одной и той же фазе роста и развития. Для контроля подбирают растения, равноценные опытным по состоянию и фазе развития. Поливать следует сначала контрольные, затем опытные растения. При выяснении возможности проникновения бактерий в растения через устьица инокуляций проводят опрыскиванием бактериальной суспензии из пульверизатора. Контрольные растения обрабатывают стерильной водой, опытные бактериальной суспензией. Инокулйрованные растения или их отдельные, органы в течение нескольких дней выдерживают ь условиях повышенной влажности.

Если заражение осуществляют в лабораторных условиях, то растения помещают под колпак или во влажное помещение, а плоды, луковицы,клубни и т.д. в кристаллизаторы или эксикаторы,, где поддерживают повышенную влажность. При заражении отдельных органов растений в полевых условиях их заключают в увлажненный пергаментный мешочек для создания более высокой влажности. Температуру следует поддерживать на уровне, способствующем проявлению болезни. Наблюдая за развитием инфекции, отмечают время появления первых признаков болезни (пятна на Листьях, стеблях или плодах,симптомы увядания, начало разрастания ткани и т.д.), характеризуют особенности ее развития и записывают дату гибели растения или отмирания отдельных его органов.

При окончательном определении результатов искусственного заражения в случае сосудистых бактериозов готовят продольные и поперечные срезы стеблей растений с целью выявления бактерий в сосудах и установления интенсивности развития патологического процесса. Из потемневших участков, расположении выше и ниже мест внесения бактерий, готовят мазки или отпечатгат и окрашивают их по Граму. Если при микроскопированйи на препаратах обнаруживают значительное количество однородных клеток, сходных по морфологическим призвэкзд с изутеемым микроорганизмом, то делают заключение о патогенности культуры.
В большинстве случаев при искусственном заражении развитие болезни сопровождается появлением характерных признаков, что дает возможность судить о патогенности культуры. Если внешние признаки болезни не типичны, то необходимо вновь выделить культуру бактерий из участков, находящихся на некотором расстоянии от мест уколов.

Исследование морфологии бактериальных клеток. Если изолированные из растений бактерии окажутся фитопатогенкыда, то приступают к исследованию морфологии клеток. Для этого готовят препараты (неокрашенные и окрашенные), которые рассматривают под микросковом. Исследовать лучше неокрашенные препараты, так как высушивание, применяемое при изготовлении окрашенных препаратов, вызывает илаэмолиз содержимого клетки, что несколько изменяет ее нормальную форму. Живые бактерии изучают в раздавленной или висячей капле. В раздавленной капле прижизненный препарат готовят следующим образом. На чистое предметное отекло наносят каплю стерильной водопроводной воды, в нее нетлей вносят небольшое количество микроорганизмов, выращенных на плотной питательной среде, и осторожно смешивают с водой. Очень густую смесь разбавляют, переносят петлей в кашпо вода на другое предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

Если бактерии выращены в жидкой питательной среде, то на предметное стекло наносят кашпо этой жидкости петлей или пипеткой, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом с обычными объективом или иммерсионной системой. Для приготовления прижизненных препаратов применяют одаосуточные или более молодые культуры бактерий, чтобы лучше рассмотреть их подвижность. При наблюдении необходимо отличать активную подвижность бактерий (когда клетки передвигаются в поле зрения во всех направлениях) от броуновского движения, носящего пассивный характер. Висячие капли используют для длительных наблюдений подвижности и размножения бактерий. Небольшую каплю негустой взвеси бактерий наносят в нентр стерильного покровного стекла, края которого предварительно смазывают вазелином (во избежание высыхания капли) с помощью стеклянной палочки.

Перевернутое покровное стекло с висячей каплей накладывают на стерильное предметное стекло с углублением (луночкой) посередине так, чтобы капля висела над углублением, не прикасаясь к предметному стеклу. Движение бактерий обычно наблюдают в висячей капле, взятой из 12-14-часовой или однооуточной жидкой бульонной культуры. Если бактерии при первом просмотре окажутся неподвижными, то пробирку с культурой помещают в термостат и вновь проверяют подвижность бактерий 3-4 дня подряд. Поскольку некоторые бактерии очень быстро теряют жгутики, рекомендуют первое наблюдение проводить через несколько часов после посева в бульон.

Для прижизненной окраски используют небольшие концентрации (от 0,01 до 0,0001) водных растворов различных красок (метйленовая синяя, нейтральная красная, зеленый янус, эозин, эритроэин и др.), которые не оказывают на микроорганизмы губительного действия. Бактерии вносят в кашпо краски на предметном стекле и накрывают покровным стеклом.
Окрашенные препараты обычно готовят на чистых обезжиренных предметных стеклах, чтобы нанесенная на них взвесь бактерий растекалась по стеклу, а не собиралась в виде капель. Простейший способ очистки стекол фламирование (2-3-кратное) с последующим протиранием фильтровальной бумагой или натиранием подсохшим кусочком мыла с удалением образовавшегося слоя фильтровальной бумагой.

Приготовление мазка. Его готовят на чистом обезжиренном предметном стекле. Вначале наносят маленькую каплю стерильной воды. Затем петлей берут небольшое количество культуры с плотной пита­тельной среды, смешивают с водой и равномерно распределяют по поверхности стекла более тонким слоем. При приготовлении мазков из культур, выращенных на жидких средах, кашпо исследуемой жидкости распределяет по поверхности стекла.

Высушивание. Обычно мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре без нагревания. Для ускорения высыхания препарат можно слегка подогреть, держа стекло высоко над пламенем горелки мазком вверх. Следует помнить, что осторожное высушивание способствует сохранению структуры клетки.

Фиксация. Высушенный мазок фиксируют, чтобы обеспечить лучшее прилипание бактерий к стеклу и сделать их более восприимчивыми к окраске. Самый распространенный способ фиксация пламенем. Для этого, взяв стекло за края так, чтобы мазок был обращен кверху, проводят его 3 раза через верхнюю часть пламени горелки и нагревают нижнюю поверхность стекла. Однако при нагревании клетки могут несколько изменить форму, поэтому при изучении строения клетки фиксацию проводят 95° этиловым спиртом в течение 10-15 мин или смесью с эфиром (1:1) в течение 2-5 мин. Фиксировать можно Также смесью этилового спирта с формалином (формалина 5 мл, спирта 95 мл) 5-10 мин, парами формалина или уксусной кислоты 5-10 мин, парами 1-2% раствора осмиевой кислоты 3-5 в последнем случае фиксацию проводят в закрытой склянке, помещая препарат на подставку.

Окраска. Существует много различных способов окраски бактерий, которые применяют в зависимости от целей изучения. Простую окраску делают при исследовании формы микроорганизмов. На мазок наливают раствор краски, покрыв всю его поверхность. Продолжительность окрашивания (3-5 минут) зависит от крепости краски и вида бактерий. Мазки с агара хорошо красятся метиленовой синей, фуксином или сафранином. Препарат, выращенные на бульоне и молоке, следует красить мэтиленовой синей, так как фуксин окрашивает органические вещества этих сред .

Промывание. По истечение экспозиции окраски краску сливают и препарат промывают водой. Затем мазок высушивают фильтровальной бумагой, слегка прикасаясь ею к препарату (но не передвигая). После высушивания препарат рассматривают под микроскопом (лучше с помощью иммерсионной системы). Изучение кулиуральннх и биохимических свойств бактерий. Морфологическое однообразие фитопатогенных бактерий затрудняет их идентификацию. Поэтому для определения вида возбудителей бактериозов, помимо их патогенности в отношении растений хозяев и морфологических признаков, необходимо знать культуральные и биохимические свойства. Культуралыше признаки выявляют по характеру роста бактерий на твердых и жидких питательных средах (на скощенной поверхности агара, мясопептонном бульоне, желатиновом столбике, средах Кона, Ушинского, Ферми, Георгия и Поэ). Биохимические свойства бактерий устанавливают по изменениям специальных питательных сред и путем определения продуктов их жизнедеятельности ( МИА (косячки), МПА о крахмалом, МТБ, МПБ с селитрой, молоко, молоко о лакмусом, картофель (косячки), среды с различными углеводами и индикатором и т.д.). В процессе этого проверяют диастическую активность бактерий, способность к редукции нитратов, образованию индола, выделению аммиака, отношение бактерий к молоку, сахарам и другим соединениям углерода, способность вызвать мацерацию тканей .

Определение бактерий. Доказав, что изолированные из растения бактерии способны вызывать заболевание данного растения, и изучив их морфологические и кульгурально-биохимические свойства, приступают к определению видовой принадлежности возбудителей бактериозоа Полученные данные о свойствах изучаемых бактерий записывают в журнал и сравнивают со свойствами бактерий, в качестве возбудителей бактериозов данного растения.

Вирусные заболевания. Применяют следующие методы: визуальный, растенийиндикаторов, электронной микроскопии и серологический.

Визуальный метод основан на способности вирусных болезней вызывать у пораженных растений характерные симптомы. Для своевременного выявления вирусных болезней проводят регулярные маршрутные обследования растений в течение вегетационного периода. Для оценки степени проявления болезни используют глазомерные шкалы, обычно 5-балльную щкалу, или определяют процент поверхности пораженной ткани учетного растения. Существуют следующие градации 5-балльной шкалы: 0 - растение здоровое; 1 - слабое поражение растения; 2 - поражение среднее; 3 - растение поражено в сильной степени; 4 - сильное поражение растения, его гибель. Следует отметить, что такие признаки, как угнетение роста, хлороз, деформация и мозаичность листьев могут возникнуть не только в результате заражения вирусами, но и под воздействием различных факторов внешней среды.

К таким факторам относятся нарушение условий освещенности, неблагоприятное влияние температуры и влажности, нарушение минерального питания. Опрыскивание ядохимикатами также может отрицательно воздействовать на растения и вызывать симптомы,подобные таковым вирусйых болезней.В этих случаях необходимо установить инфекционность заболевания, т.е. способность передаваться от больного растения здоровому. Первичная диагностика по симптомам значительно облегчает последующее определение вируса и его свойств. Подтверждение вирусной природы заболевания возможно лишь при использовании более сложных методов растений индикаторов, электронной микроскопии, серологического.

Индикаторный метод (биологическая проверка) позволяет выявлять вирусные болезни с наибольшей достоверностью при механической передаче вируса с соком больных растений на травянистые тестрастения. Проверка проводится в специальных теплицах. Растения индикаторы выращивают в вазонах со стерильным (пропаренным) субстратом (смесь почвы, песка, торфа в соотношении 3:13). Для тестирования используют растения индикаторы в фазе от 2-4 пар настоящих листьев.

Не менее 5 растений в каждом тесте маркируют с указанием вида индикатора, номера образца и даты проверки. Листья растений индикаторов опудрквают карборундом. С испытуемых растений берут 2-3 молодых листочка с четкими симптомами вирусного заболевания, помещают в фарфоровую ступку и пестиком растирают с буферной смесью на одну часть гамогената два части буферного раствора. Полученной суспензией натирают листья индикаторных растений. Применяют следующие буферные смеси.

Фосфатная смесь Соренсена III; буфер гфиготовшот смешиванием двух растворов натрия фосфорнокислого двузамещенного 11,876 г/л и 9,5та г/л. Соотношение растворов для получения нужного рН приводится в Краткой справочнике по физиологии растений (1%4). Буферная смесь Соренсева для приготовления 1 л буферной смеси со стабилизирующими добавками требуются; Ма2НРО.-12Н2 (20,14 г), КН2Р94 (1,042 г), дифенилтиомочевина (0,276 г), диэтилдатиокарбамат (0,202 г). Каждую навеску отдельно растворяют в дистиллированной воде в стеклянной посуде. Полученные растворы сливают в мерную колбу и общий объем доводят до 1 л дистиллированной водой. В качестве буферной смеси используют водные растворы 2-3% концентрации никотинсульфата.

Электронно микроскопический метод применяют для быстрого и пршлого обнаружения вирусных частиц. Острой бритвой срезали край листа больного растения и погружали на 1-2 с в каплю дистиллированной вода, помещенную предварительно на сетку с коллодиевой пленкой. После высыхания жидкости препарат напыляли металлом и просматривали в электронном микроскопе. Этот метод можно использовать для диагностики вирусов с нитевидной и палочковидной формой частиц.

Для обнаружения сферических частиц вируса применяют следующий метод. На сетку с пленкойподложкой наносят каплю 2% раствора фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК),рН = 7,2. В эту каплю помещают кусочек сдернутого эпидермиса так, чтобы пораненная сторона с ней соприкоснулась. Затем эпидермис быстро оттягивают, а остаток капли удаляют фильтровальной бумагой. В таком виде сеточку можно сразу помещать в электронный, микроскоп для просматривания (19 000-30 000 раз). На каждое проверяемое растение препарат готовят в 3-кратной повторности.

Серологический метод основан на специфической реакции между исследуемым вирусом и антисывороткой, полученной к атому вирусу. Наиболее распространена реакция преципитации методом двойной диффузии в агаровом геле. Для приготовления агарового геля используют 0,9% бактоагар, 0,9% НаС1 и щиисегаики -0,02% вдави (азид натрия) или 9,02% мертиолат (для предупреждения развития грибов и бактерий). Разогретый агаровый гель разливдат в стерильные чашки Петри по 10 мл в каждую .
После охлаждения в слое агара специальным пробойником вырезают лунки и с наружной стороны чашки их маркируют. В центр лунки пасте­ровской пипеткой помещают сыворотку, а по периферии размещают антиген в 3-кратной повторности. Антиген и антитело диффундируют навстречу друг другу; через сутки визуально наблюдают полосы преципитации.

Go to top